### 四、定点突变引物设计与PCR扩增

#### 1. 引物设计要求

在进行定点突变引物设计时，需满足以下要求：引物的5’端应包含15-21bp的反向互补区域，以及至少15bp的非互补区域。反向互补区域的GC含量需保持在40%-60%之间，同时待突变位点应至少在引物的3’端，且Tm值设定为60°C。可依据实验需求选择合适模块进行引物设计。

#### 2. PCR扩增建议

建议采用试剂盒中配套的扩增模块进行PCR扩增，并根据需要探索适宜的退火温度，以优化反应体系和程序。对于PCR扩增体系，模板质粒的投入量建议为50μl体系中添加1ng的质粒，扩增循环数不应超过35个。

### 扩增产物的消化与纯化

#### 1. DpnI消化

取5μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定目标条带后，剩余产物需进行DpnI消化（在45μl扩增产物中加入1μl DpnI，轻轻混匀并在PCR仪中于37°C反应1-2小时进行质粒模板的消化；后续在70°C反应15分钟以失活DpnI）。

#### 2. 纯化回收方法

推荐使用切胶回收法进行纯化，切胶时间控制在3分钟以内以避免紫外线对DNA的损害。使用NanoDrop或OneDrop等仪器检测回收浓度，确保其达到≥20ng/μl，并通过跑胶方法确认回收的产物为单一目标条带。若回收浓度较低，可通过增加反应体系，采用多管反应单管回收的方式提高回收产品的浓度。

### 重组反应

#### 1. 连接反应体系

根据说明书要求计算连接反应各组分的投入量，体系中每种组分的投入体积需≥1μl。如浓度较高，可适度稀释后使用。

#### 2. 连接反应程序

按照说明书要求进行连接反应，建议在PCR仪中进行反应以提高效率。

### 感受态细胞转化

#### 1. 细胞选择

为连接产物转化，推荐使用DH5α、Fast-T1等克隆用化学感受态细胞。使用感受态细胞时需避免反复冻融，-80°C取出后应一次性使用。

#### 2. 反应与体积设置

重组产物与感受态细胞的体积比例应为1:10。推荐将10μl的重组产物加入至100μl感受态细胞中，或将5μl重组产物加入至50μl感受态细胞中。热激时间按照感受态细胞说明书操作进行，并且转化所用平板的抗生素抗性需与载体的抗性一致。

#### 3. 菌液涂板

菌液需离心（2500×g，3分钟），移去多余的LB培养基，保留100μl重悬后全部涂板，或吸取适当体积进行涂板。

### 常见问题解决方案

#### 1. 质粒模板无法正常扩增

可能原因包括引物设计错误，反向互补区域应为15-21bp，且GC含量需在40-60%之间。建议使用南宫28品牌的CEDesign在线设计工具进行引物设计；若质粒模板质量差，需进行凝胶电泳检测，若出现开环、线性条带或拖尾，则需重新制备质粒。

#### 2. PCR反应设置不当

如质粒模板投入量过多，可能会抑制PCR反应，推荐在50μl体系中投入1ng的质粒。应依据上下游引物的Tm值进行合理设置，并进行适宜范围的梯度摸索。在质粒长度超过8kb时，考虑采用双/多点突变策略进行分段扩增。

#### 3. 非目标位点碱基突变

若突变位于引物区域，建议重新合成引物并再次实验；如突变位于其他部位，应使用高保真酶重新制备模板进行实验。通过使用南宫28的高保真酶，可以有效提高突变的精确性和效率。