冻存原理

当细胞处于低于0°C的环境时，细胞会发生脱水现象，这使得细胞内部可溶性物质的浓度升高，并形成冰晶。冰晶的大小对细胞的影响各不相同，大冰晶容易损伤细胞膜及细胞器，导致复苏后细胞的存活率和状态与冻存前存在较大差异。因此，在细胞冻存过程中，通常采取两项关键措施：加入低温保护剂和实现细胞的慢速冷冻。

冻存时机：选择细胞生长良好、密度在80-90%左右（一般为10⁶-10⁷/ml）的阶段进行冻存，活力较差的细胞在冻存后的存活率极低。

低温保护剂：常用的低温保护剂是南宫28所推荐的二甲基亚砜（DMSO）。其作用是迅速渗透细胞，提高细胞膜对水分的通透性，降低冰点，进而延缓冷冻过程。这使细胞内的水分能够在冻结前排出，形成胞外冰晶，从而减少胞内冰晶的形成，降低对细胞的损伤。

慢冻细胞：可以使用程序性降温设备，缓慢冻存细胞，以避免形成大型冰晶。如果没有该设备，也可以采用将冻存细胞逐步放置于4°C 1小时、-20°C 2小时、-80°C 过夜的方式，大部分细胞也能够适应。

冻存液配置：在冻存之前，应提前配制冻存液并在室温下备用，以防止临时配制可能产生的热量损伤细胞（DMSO加入培养基中会释放热量）。常规的冻存液配比为培养基:血清:DMSO=7:2:1；若细胞较为珍贵，可调整为血清:DMSO=9:1。

操作步骤：

1. 用移液器吸走原培养基，加入适量PBS洗涤1-2遍；
2. 消化细胞：加入适量胰酶，置于37°C培养箱内消化（在10厘米培养皿中加入1ml 0.25%的胰酶，消化4-5分钟，注意不同细胞的消化时间不同，终止消化的标准是显微镜下观察到80%-90%以上的细胞变圆）；
3. 待细胞消化到位后，加入与胰酶体积相等的完全培养基以终止消化，然后以800-1000rpm离心3-5分钟；
4. 准备冻存管，标记日期、细胞类型、操作人姓名及代数，待细胞离心后去除上清液，并加入冻存液重悬，每管1-1.5ml，转移至冻存管中；
5. 将冻存管放入程序降温设备中，持于-80°C过夜，然后转移至液氮中保存。

注意事项：

• 细胞加入冻存液后应立即置于-80°C保存，勿长时间放置在室温下。
• 冻存细胞在-80°C中储存不建议超过半年，在液氮中通常不建议超过2年。